Yfirlit Rvei-041 2.02.57 Útg. 13.0 Útg.dagur 12/28/2023

2.02.57 Kjarnsýrumögnun (Polymerase Chain Reaction, PCR)

PCR er sértæk fjölföldun (afritun/mögnun) tiltekinna basaraða í

DNA

-kjarnsýrum. Ef magna á raðir í RNA-kjarnsýru þarf fyrst að framkvæma bakritun/víxlritun (Reverse Transcription, RT) til að fá cDNA, sem síðan er hægt að magna upp.

Fræðilega ætti að vera hægt að fá tvöföldun eintaka í hverri umferð við kjöraðstæður, en það er þó ekki raunin.

Fyrir því eru ýmsar ástæður, t.d. samkeppni milli vísa (prímera) og magnaðrar afurðar um bindingu við markraðirnar sem á að magna. Yfirleitt er raunhæft að keyra 35-45 umferðir, en mögnun hægir á sér og stöðvast undir lokin (sjá mynd), auk þess sem ruslmögnun eykst.

Mögnunin byggir á endurteknum breytingum á hitastigi (thermocycling) sem er tölvustýrt af mikilli nákvæmni í sérstöku PCR-tæki (thermocycler). Algengast er að notuð séu þrjú mismunandi hitastig (eðlissvipting - þáttapörun - lenging), en þáttapörun og lenging eru stundum sameinuð í sama hitastigi.

Eðlissvipting (denaturation). Tvíþátta DNA er klofið í einþátta með hitun, t.d. 95°C í nokkra tugi sekúndna.
Þáttapörun (annealing). Hitinn er lækkaður nægilega mikið til að sértækir einþátta fjölnúkleotíðbútar (prímerar, vísar) nái að parast við þær basaraðir sem leitað er að, séu þær til staðar í sýninu. Þetta gæti t.d. verið 50°C í nokkra tugi sekúndna.
Lenging (extension). Hitinn er hækkaður upp í kjörhitastig hitastöðugs ensíms, t.d. Taq polymerasa, sem prjónar við prímerana sem hafa parast við kjarnsýrur í sýninu og býr þannig til mótþráð við þann sem fyrir er. Gjarnan 60-72°C í nokkra tugi sekúndna.

Þetta er svo endurtekið eins og þurfa þykir, að jafnaði 40 umferðir.

Aflestur:

Ýmsar aðferðir eru notaðar til að mæla að mögnun hafi átt sér stað:

Einfaldasta aðferðin í hefðbundnu PCR er rafdráttur og litun, t.d. með ethidiumbrómíði eða SYBR green, flúrljómandi efnasamböndum sem bindast þáttanna í tvíþátta DNA og við það margfaldast flúrljómun þeirra. Síðan eru teknar myndir af flúrljómandi "böndum" í gelunum undir útfjólubláu ljósi.
Með því að "merkja" vísa og/eða þreifa með virkum efnahópum er hægt að beita ýmsum úrvinnsluaðferðum eftir að mögnun er lokið. Dæmi um þetta eru ELOSA (enzyme-linked-oligosorbent-assay), einföld litrófsmæling sem svipar til ELISA, eða Luminex xTAG sem byggir á mun flóknari tækni.
Í stað hefðbundins aflesturs með gelkeyrslu í lok mögnunar, er nú lesið sé af með mælingu á flúrljómun meðan á mögnun stendur (rauntíma PCR). Með þessu móti verður rafdráttur óþarfur.

Nokkur hugtök og skilgreiningar:

Nested PCR: Tvöfalt PCR. Fyrst er magnað upp tiltölulega stórt svæði, en síðan er tekið sýni úr þeirri mögnun og flutt yfir í nýtt PCR með vísum sem liggja nær hvor öðrum en fyrri (ytri) vísarnir.
Semi-nested PCR: Líka tvöfalt PCR, en hér er aðeins öðrum vísinum úr fyrri mögnuninni skipt út.
Multiplex: Fleiri en eitt sett af prímerum saman í sama hvarfinu. Þannig er t.d. hægt að leita að nokkrum ólíkum veirum í einu, eða leita að fleiri en einu geni tiltekinnar veiru samtímis. Þetta er mjög hagkvæmt, en kemur oft niður á næmi og veldur oft ruslmögnun. Vel þarf að vanda val á vísum ef þetta á að virka.
Rauntíma PCR, rt-PCR: Fylgst er með mögnun í rauntíma á tölvuskjá, en ekki bara í lokin eins og í hefðbundnu PCR.
Til þess eru yfirleitt notaðir flúrmerktir þreifarar (próbar).

PCR próf eftir veirum

Sýni og sýnataka

Sending og geymsla

Niðurstöður

Veira (veirur)	Kjarnsýra	Gerð prófs*	Staða prófs
Adeno	DNA	rt-PCR	Í notkun
Astro	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Bólusótt o.fl. orthopoxveirur t.d MPX	DNA	rt-PCR	Í notkun
Chikungunya	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
CMV (Cytomegaloveira)	DNA	rt-PCR eða rt-PCR magnmæling	Í notkun
Coronaveirur (NL63, HKU1, OC43 og 229E)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Dengue	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Entero (þ.m.t. Coxsackie, ECHO, Polio og Entero 68)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
EBV (Epstein Barr veira)	DNA	rt-PCR eða rt-PCR magnmæling	Í notkun
Hepatitis B magnmæling	DNA	Cobas 8800 magnmælingarpróf (Roche)	Í notkun
Hepatitis C magnmæling	RNA	Cobas 8800 magnmælingarpróf (Roche)	Í notkun
Hepatitis C veiruarfgerð	RNA	rt-PCR	Í notkun
Hepatitis E	RNA	rt-PCR	Sent til útlanda
Herpes 6	DNA	rt-PCR	Í notkun
Hettusótt	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
HIV-1 magnmæling	RNA	Cobas 8800 magnmælingarpróf (Roche)	Í notkun
HIV-1- RNA Lyfjanæmi	RNA	RT-PCR og raðgreining	Í notkun
Hlaupabóla/ristill (VZV)	DNA	rt-PCR	Í notkun
HSV-1 og 2 (Herpes simplex veirur)	DNA	rt-PCR	Í notkun
Inflúensa A og B	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Inflúensa A týpugreining (H1/H3/H1pdm09)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Inflúensa A fuglaflensur (H5/H7)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
MERS-CoV (Miðausturlanda-Coronaveira)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Metapneumoveira (hMPV)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Mislingar	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Noro G1 og G2 (Calici)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
ORF (Sláturbóla)	DNA	rt-PCR	Í notkun
Human papilloma virus (HPV)	DNA	nested-PCR, raðgreining	Í notkun
Paraecho	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Parainflúensa	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Parvo B19	DNA	rt-PCR	Í notkun
Polyoma (JCV/BKV)	DNA	rt-PCR eða rt-PCR magnmæling	Í notkun
Rauðir hundar (Rubella)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Rota	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
RSV (Respiratory syncytial veirur)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
RSV týpun (A og B)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Rhino (kvefveirur)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Sapo (Calici)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
SARS-CoV-2 (COVID-19)	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Syphilis (sárasótt)	DNA	rt-RT-PCR	Í notkun
Zika	RNA	rt-RT-PCR	Í notkun

2.02.57 Kjarnsýrumögnun (Polymerase Chain Reaction, PCR)

Ritstjórn

Samþykkjendur

Ábyrgðarmaður

Útgefandi