../ IS  
Útgefið gæðaskjal: Yfirlit
Skjalnúmer: Rvei-041
Útg.dags.: 12/28/2023
Útgáfa: 13.0
2.02.57 Kjarnsýrumögnun (Polymerase Chain Reaction, PCR)

    PCR er sértæk fjölföldun (afritun/mögnun) tiltekinna basaraða í DNA-kjarnsýrum. Ef magna á raðir í RNA-kjarnsýru þarf fyrst að framkvæma bakritun/víxlritun (Reverse Transcription, RT) til að fá cDNA, sem síðan er hægt að magna upp.




    Fræðilega ætti að vera hægt að fá tvöföldun eintaka í hverri umferð við kjöraðstæður, en það er þó ekki raunin. Fyrir því eru ýmsar ástæður, t.d. samkeppni milli vísa (prímera) og magnaðrar afurðar um bindingu við markraðirnar sem á að magna. Yfirleitt er raunhæft að keyra 35-45 umferðir, en mögnun hægir á sér og stöðvast undir lokin (sjá mynd), auk þess sem ruslmögnun eykst.

    Mögnunin byggir á endurteknum breytingum á hitastigi (thermocycling) sem er tölvustýrt af mikilli nákvæmni í sérstöku PCR-tæki (thermocycler). Algengast er að notuð séu þrjú mismunandi hitastig (eðlissvipting - þáttapörun - lenging), en þáttapörun og lenging eru stundum sameinuð í sama hitastigi.


    1. Eðlissvipting (denaturation). Tvíþátta DNA er klofið í einþátta með hitun, t.d. 95°C í nokkra tugi sekúndna.
    2. Þáttapörun (annealing). Hitinn er lækkaður nægilega mikið til að sértækir einþátta fjölnúkleotíðbútar (prímerar, vísar) nái að parast við þær basaraðir sem leitað er að, séu þær til staðar í sýninu. Þetta gæti t.d. verið 50°C í nokkra tugi sekúndna.
    3. Lenging (extension). Hitinn er hækkaður upp í kjörhitastig hitastöðugs ensíms, t.d. Taq polymerasa, sem prjónar við prímerana sem hafa parast við kjarnsýrur í sýninu og býr þannig til mótþráð við þann sem fyrir er. Gjarnan 60-72°C í nokkra tugi sekúndna.

      Þetta er svo endurtekið eins og þurfa þykir, að jafnaði 40 umferðir.


      Aflestur:
      Ýmsar aðferðir eru notaðar til að mæla að mögnun hafi átt sér stað:
    • Einfaldasta aðferðin í hefðbundnu PCR er rafdráttur og litun, t.d. með ethidiumbrómíði eða SYBR green, flúrljómandi efnasamböndum sem bindast þáttanna í tvíþátta DNA og við það margfaldast flúrljómun þeirra. Síðan eru teknar myndir af flúrljómandi "böndum" í gelunum undir útfjólubláu ljósi.
    • Með því að "merkja" vísa og/eða þreifa með virkum efnahópum er hægt að beita ýmsum úrvinnsluaðferðum eftir að mögnun er lokið. Dæmi um þetta eru ELOSA (enzyme-linked-oligosorbent-assay), einföld litrófsmæling sem svipar til ELISA, eða Luminex xTAG sem byggir á mun flóknari tækni.
    • Í stað hefðbundins aflesturs með gelkeyrslu í lok mögnunar, er nú lesið sé af með mælingu á flúrljómun meðan á mögnun stendur (rauntíma PCR). Með þessu móti verður rafdráttur óþarfur.


      Nokkur hugtök og skilgreiningar:
    • Nested PCR: Tvöfalt PCR. Fyrst er magnað upp tiltölulega stórt svæði, en síðan er tekið sýni úr þeirri mögnun og flutt yfir í nýtt PCR með vísum sem liggja nær hvor öðrum en fyrri (ytri) vísarnir.
    • Semi-nested PCR: Líka tvöfalt PCR, en hér er aðeins öðrum vísinum úr fyrri mögnuninni skipt út.
    • Multiplex: Fleiri en eitt sett af prímerum saman í sama hvarfinu. Þannig er t.d. hægt að leita að nokkrum ólíkum veirum í einu, eða leita að fleiri en einu geni tiltekinnar veiru samtímis. Þetta er mjög hagkvæmt, en kemur oft niður á næmi og veldur oft ruslmögnun. Vel þarf að vanda val á vísum ef þetta á að virka.
    • Rauntíma PCR, rt-PCR: Fylgst er með mögnun í rauntíma á tölvuskjá, en ekki bara í lokin eins og í hefðbundnu PCR.
      Til þess eru yfirleitt notaðir flúrmerktir þreifarar (próbar).
    Veira (veirur) Kjarnsýra Gerð prófs* Staða prófs
    Adeno DNA rt-PCR Í notkun
    Astro RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Bólusótt o.fl. orthopoxveirur t.d MPX DNA rt-PCR Í notkun
    Chikungunya RNA rt-RT-PCR Í notkun
    CMV (Cytomegaloveira) DNA rt-PCR eða rt-PCR magnmæling Í notkun
    Coronaveirur (NL63, HKU1, OC43 og 229E) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Dengue RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Entero (þ.m.t. Coxsackie, ECHO, Polio og Entero 68) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    EBV (Epstein Barr veira) DNA rt-PCR eða rt-PCR magnmæling Í notkun
    Hepatitis B magnmæling DNA Cobas 8800 magnmælingarpróf (Roche) Í notkun
    Hepatitis C magnmæling RNA Cobas 8800 magnmælingarpróf (Roche) Í notkun
    Hepatitis C veiruarfgerð RNA rt-PCR Í notkun
    Hepatitis E RNA rt-PCR Sent til útlanda
    Herpes 6 DNA rt-PCR Í notkun
    Hettusótt RNA rt-RT-PCR Í notkun
    HIV-1 magnmæling RNA Cobas 8800 magnmælingarpróf (Roche) Í notkun
    HIV-1- RNA Lyfjanæmi RNA RT-PCR og raðgreining Í notkun
    Hlaupabóla/ristill (VZV) DNA rt-PCR Í notkun
    HSV-1 og 2 (Herpes simplex veirur) DNA rt-PCR Í notkun
    Inflúensa A og B RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Inflúensa A týpugreining (H1/H3/H1pdm09) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Inflúensa A fuglaflensur (H5/H7) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    MERS-CoV (Miðausturlanda-Coronaveira) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Metapneumoveira (hMPV) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Mislingar RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Noro G1 og G2 (Calici) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    ORF (Sláturbóla) DNA rt-PCR Í notkun
    Human papilloma virus (HPV) DNA nested-PCR, raðgreining Í notkun
    Paraecho RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Parainflúensa RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Parvo B19 DNA rt-PCR Í notkun
    Polyoma (JCV/BKV) DNA rt-PCR eða rt-PCR magnmæling Í notkun
    Rauðir hundar (Rubella) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Rota RNA rt-RT-PCR Í notkun
    RSV (Respiratory syncytial veirur) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    RSV týpun (A og B) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Rhino (kvefveirur) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Sapo (Calici) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    SARS-CoV-2 (COVID-19) RNA rt-RT-PCR Í notkun
    Syphilis (sárasótt) DNA rt-RT-PCR Í notkun
    Zika RNA rt-RT-PCR Í notkun
        * rt-PCR=rauntíma-PCR, nested PCR=tvöfalt PCR, RT-PCR=PCR með bakritun (RNA), rt-RT-PCR=rauntíma-PCR með bakritun, rt-PCR/rt-PCR magnmæling=rauntíma-PCR sem hægt er að keyra sem magnmælingu ef staðlar (standardar) eru notaðir.

        Svartími:
        Mjög mismunandi er hversu fljótt má vænta svars úr PCR-prófum.
        Próf fyrir herpesveirur og aðrar DNA veirur eru gerðar alla virka daga. Hægt er að gera hrað-próf á mænuvökvum um helgar.
        Iðrakveisuveirur og öndunarfæraveirur eru gerð alla virka daga og einnig um helgar.
        Próf fyrir enteroveirur eru að jafnaði gerð þrisvar í viku.
        Önnur próf (t.d. magnmæling á HIV, HBV, HCV o.fl. veirum) eru gerð að jafnaði 1 sinni í viku.
        Mjög mismunandi er hversu fljótt má vænta svars úr PCR prófum sem send eru á erlendar rannsóknastofur.

        Túlkun:
        Sérfræðilæknar veirurannsókna metur þörfina fyrir túlkun niðurstaðna.


        Ritstjórn

        Jana Birta Björnsdóttir - janabbjo
        Máney Sveinsdóttir - maney
        Arthur Löve
        Ásgeir Erlendur Ásgeirsson
        Brynja Ármannsdóttir - brynjaa
        Guðrún Erna Baldvinsdóttir

        Samþykkjendur

        Ábyrgðarmaður

        Guðrún Svanborg Hauksdóttir - gusvhauk

        Útgefandi

        Máney Sveinsdóttir - maney

        Upp »

        Skjal fyrst lesið þann 08/24/2011 hefur verið lesið 15163 sinnum